Луч - BEAMing

Луч, который обозначает шарики, эмульсию, усиление, магнетизм, является высокочувствительным цифровая ПЦР метод, сочетающий эмульсионную ПЦР и проточной цитометрии для выявления и количественной оценки конкретных соматических мутаций, присутствующих в ДНК.

Обработать

BEAMing начинается с выделения ДНК из образца крови или плазмы пациента. Целевые области очищенной ДНК подвергаются стадии предварительной амплификации с помощью стандартной ПЦР с использованием праймеров с известными последовательностями для амплификации интересующих генетических областей.

Затем амплифицированные матрицы ДНК вводят в праймеры, которые ковалентно связаны с магнитными шариками через стрептавидин -биотин взаимодействия и разделены на водные микрокапли воды в масле эмульсия. Водная фаза эмульгируется с маслом, образуя миллионы отдельных капель воды диаметром 3-10 микрон. Внутри каждой капли проводится отдельная реакция ПЦР. Из-за небольшого размера каждая капля воды содержит в среднем одну молекулу ДНК и магнитную частицу. В дополнение к предварительно амплифицированной ДНК каждая капля эмульсии содержит необходимые реагенты и покрытые праймером магнитные шарики с направленной последовательностью для проведения реакции ПЦР эмульсии. Капли микроэмульсии подвергаются циклическому изменению температуры с использованием обычных методов ПЦР. Каждая матрица ДНК (с магнитным шариком, присутствующим в водном отсеке) удлиняется и амплифицируется, в результате чего шарик покрывается тысячами идентичных копий фрагмента ДНК-матрицы.

Обычно высокое качество ДНК-полимераза используется для ограничения ошибок, обычно возникающих во время ПЦР. Эта мера предосторожности ограничивает риск ложноположительного обнаружения и позволяет точно различать целевые молекулы.[1]

После стадии эмульсионной ПЦР водная и масляная фазы разделяются, так что микрочастицы могут быть собраны в водной фазе. Затем капли микроэмульсии разбиваются, чтобы высвободить магнитные шарики, к которым прикреплены усиленные копии ДНК. Гранулы магнитно очищены и зависят от пары оснований. флуоресцентные зонды прилагаются. Это помогает различать фрагменты ДНК дикого типа и мутантные, поскольку один флуоресцентный зонд специфически связывается с ДНК дикого типа, а другой - со специфической мутантной ДНК. Каждую флуоресцентно меченную гранулу анализируют в проточном цитометре, в результате чего мутант отделяется от ДНК дикого типа, а также определяется соотношение мутантной ДНК и ДНК дикого типа, присутствующей в образце.

Микроскопические капли эмульсии, используемые в BEAMing, позволяют разделить сегменты ДНК на отдельные капли. Эмульсионная ПЦР проводится на разделенной на части ДНК, что позволяет проводить сотни миллионов реакций ПЦР параллельно. Эта массивно параллельный Платформа ПЦР обеспечивает высокий уровень чувствительности (0,001%) для обнаружения редких молекул опухолевой ДНК на большом фоне ДНК дикого типа.[2][3]

Приложения

BEAMing часто используется в исследованиях рака для оценки циркулирующей опухолевой ДНК (втДНК ), также известный как жидкая биопсия.[нужна цитата ] Он также позволяет количественно определять фракцию мутантов в образце, которую можно отслеживать с течением времени с помощью серийных измерений в плазме. Метод имеет порог чувствительности 0,01%.[4]

История

В конце 1990-х гг. Фогельштейн и Кинзлер ввел термин "цифровая полимеразная цепная реакция ”[5] при проведении исследования соматических мутаций, связанных и потенциально вызывающих колоректальный рак.[6] Основной задачей, для решения которой была разработана цифровая ПЦР, было обнаружение незначительных количеств заранее определенной соматической мутации в более крупных популяциях клеток.[7] В то время как как цифровая, так и классическая ПЦР могут использоваться для количественного или качественного анализа, цифровая ПЦР анализирует образцы по одной молекуле за раз для получения сигнала «все или ничего», тем самым увеличивая отношение сигнал / шум и общую чувствительность к редким целям.[8] Результаты этих исследований показали, что цифровая ПЦР способна надежно количественно определить относительную долю вариантных последовательностей в образце ДНК.[9]

BEAMing вырос из технологии цифровой ПЦР и в 2003 году был описан в Методы природы публикация команды Фогельштейна.[10] В 2005 году команда Фогельштейна опубликовала свои первые клинические данные о применении технологии BEAMing для анализа образцов плазмы больных раком.[11] В 2008 году Природа Медицина В публикации BEAMing измерения ctDNA были достаточно чувствительны, чтобы надежно контролировать динамику опухоли.[12]

В 2008 году была создана Inostics GmbH для коммерциализации BEAMing. В 2014 году Inostics была приобретена Sysmex Corporation сформировать Sysmex Inostics.[13]

использованная литература

  1. ^ Диль, Франк; Смергелиене, Эдита (1 сентября 2013 г.). «BEAMing for Cancer: обнаружение опухолевых мутаций в периферической крови с помощью цифровой ПЦР».
  2. ^ Диль, Франк; Ли, Мэн; Дрессмен, Девин; Он, Ипин; Шен, Донг; Сабо, Стив; Диас, Луис А .; Гудман, Стивен Н .; Дэвид, Керстин А. (2005-11-08). «Выявление и количественная оценка мутаций в плазме крови пациентов с колоректальными опухолями». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (45): 16368–16373. Дои:10.1073 / pnas.0507904102. ISSN  0027-8424. ЧВК  1283450. PMID  16258065.
  3. ^ Ли, Мэн; Диль, Франк; Дрессмен, Девин; Фогельштейн, Берт; Кинзлер, Кеннет В. (2006). «BEAMing up для обнаружения и количественной оценки редких вариантов последовательности». Методы природы. 3 (2): 95–97. Дои:10.1038 / nmeth850.
  4. ^ Ван, Джонатан С. М .; Мэсси, Чарльз; Гарсия-Корбачо, Хавьер; Мульер, Флоран; Брентон, Джеймс Д .; Калдас, Карлос; Пейси, Саймон; Бэрд, Ричард; Розенфельд, Ницан (2017). «Жидкие биопсии достигли совершеннолетия: к внедрению циркулирующей опухолевой ДНК». Обзоры природы Рак. 17 (4): 223–238. Дои:10.1038 / nrc.2017.7. PMID  28233803.
  5. ^ Морли, Александр А. (2014). «Цифровая ПЦР: краткая история». Биомолекулярное обнаружение и количественная оценка. 1 (1): 1–2. Дои:10.1016 / j.bdq.2014.06.001. ЧВК  5129430. PMID  27920991.
  6. ^ Диль, Франк; Ли, Мэн; Дрессмен, Девин; Он, Ипин; Шен, Донг; Сабо, Стив; Диас, Луис А .; Гудман, Стивен Н .; Дэвид, Керстин А. (2005-11-08). «Выявление и количественная оценка мутаций в плазме крови пациентов с колоректальными опухолями». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (45): 16368–16373. Дои:10.1073 / pnas.0507904102. ISSN  0027-8424. ЧВК  1283450. PMID  16258065.
  7. ^ Фогельштейн, Берт; Кинзлер, Кеннет В. (1999-08-03). «Цифровая ПЦР». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 96 (16): 9236–9241. Дои:10.1073 / пнас.96.16.9236. ISSN  0027-8424. ЧВК  17763. PMID  10430926.
  8. ^ Морли, Александр А. (2014). «Цифровая ПЦР: краткая история». Биомолекулярное обнаружение и количественная оценка. 1 (1): 1–2. Дои:10.1016 / j.bdq.2014.06.001. ЧВК  5129430. PMID  27920991.
  9. ^ Фогельштейн, Берт; Кинзлер, Кеннет В. (1999-08-03). «Цифровая ПЦР». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 96 (16): 9236–9241. Дои:10.1073 / пнас.96.16.9236. ISSN  0027-8424. ЧВК  17763. PMID  10430926.
  10. ^ Дрессмен, Девин; Ян, Хай; Траверсо, Джованни; Kinzler, Kenneth W .; Фогельштейн, Берт (22 июля 2003 г.). «Преобразование отдельных молекул ДНК в флуоресцентные магнитные частицы для обнаружения и подсчета генетических вариаций». Труды Национальной академии наук. 100 (15): 8817–8822. Дои:10.1073 / pnas.1133470100. ISSN  0027-8424. ЧВК  166396. PMID  12857956.
  11. ^ Диль, Франк; Ли, Мэн; Дрессмен, Девин; Он, Ипин; Шен, Донг; Сабо, Стив; Диас, Луис А .; Гудман, Стивен Н .; Дэвид, Керстин А. (2005-11-08). «Выявление и количественная оценка мутаций в плазме крови пациентов с колоректальными опухолями». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (45): 16368–16373. Дои:10.1073 / pnas.0507904102. ISSN  0027-8424. ЧВК  1283450. PMID  16258065.
  12. ^ Диль, Франк; Шмидт, Керстин; Чоти, Майкл А; Римляне, Катарина; Гудман, Стивен; Ли, Мэн; Торнтон, Кэтрин; Агравал, Нишант; Соколл, Лори (2008). «Циркулирующая мутантная ДНК для оценки динамики опухоли». Природа Медицина. 14 (9): 985–990. Дои:10,1038 / нм.1789. ЧВК  2820391. PMID  18670422.
  13. ^ «ОБНОВЛЕНИЕ: японская Sysmex приобретает немецкую Inostics, Partec». GenomeWeb. Получено 2017-10-17.