Считыватель планшетов - Plate reader

Считыватели планшетов, также известный как считыватели микропланшетов или же фотометры для микропланшетов, инструменты, которые используются для обнаружения биологический, химический или же физический события образцов в микротитрационные планшеты. Они широко используются в исследованиях, открытие лекарств,[1] валидация биопроб, контроль качества и производственные процессы в фармацевтической и биотехнологической промышленности и академических организациях. Реакции образцов могут быть проанализированы в микротитровальных планшетах формата 1-1536 лунок. Наиболее распространенным форматом микропланшетов, используемым в академических исследовательских лабораториях или клинико-диагностических лабораториях, является 96-луночный (матрица 8 на 12) с типичным реакционным объемом от 100 до 200 мкл на лунку. Микропланшеты с более высокой плотностью (384- или 1536-луночные микропланшеты) обычно используются для скрининга, когда пропускная способность (количество образцов, обрабатываемых в день) и стоимость анализа на образец становятся критическими параметрами, при типичном объеме анализа от 5 до 50 мкл на лунку. . Обычными режимами обнаружения для анализов на микропланшетах являются абсорбция, флуоресценция интенсивность, свечение, флуоресценция с временным разрешением, и поляризация флуоресценции.

Методы

Абсорбция

Определение абсорбции доступно в ридерах для микропланшетов более 3 десятилетий и используется для таких анализов, как ELISA анализы, количественное определение белков и нуклеиновых кислот или анализы активности ферментов[2] (т.е. в МТТ анализ для жизнеспособности клеток).[3] Источник света освещает образец, используя определенную длину волны (выбранную оптическим фильтром или монохроматором), а детектор света, расположенный на другой стороне лунки, измеряет, сколько исходного (100%) света проходит через образец. : количество прошедшего света обычно зависит от концентрации интересующей молекулы. Несколько обычных колориметрический Анализы были уменьшены для количественной работы в планшет-ридере с производительностью, подходящей для исследовательских целей. Примеры преобразований анализов в методы считывания планшетов включают несколько аммоний, нитрат, нитрит,[4] мочевина,[5] железо (II),[6] и ортофосфат.[7] Более поздние колориметрические химические составы были разработаны непосредственно для использования в планшетных ридерах.[8]

Флуоресценция

Обнаружение интенсивности флуоресценции получило очень широкое развитие в формате микропланшетов за последние два десятилетия. Диапазон применений намного шире, чем при использовании определения оптической плотности, но оборудование обычно дороже. В этом типе приборов первая оптическая система (система возбуждения) освещает образец с использованием определенной длины волны (выбранной с помощью оптического фильтра или монохроматора). В результате освещения образец излучает свет (флуоресцирует), а вторая оптическая система (система излучения) собирает излучаемый свет, отделяет его от возбуждающего света (с помощью фильтра или системы монохроматора) и измеряет сигнал с помощью световой детектор, такой как фотоумножитель трубка (ФЭУ). Преимуществами обнаружения флуоресценции перед обнаружением поглощения являются чувствительность, а также диапазон применения, учитывая широкий выбор доступных сегодня флуоресцентных меток. Например, метод, известный как визуализация кальция измеряет интенсивность флуоресценции кальций-чувствительные красители для оценки уровня внутриклеточного кальция.[нужна цитата ]

Люминесценция

Люминесценция - это результат химической или биохимической реакции. Обнаружение люминесценции оптически проще, чем обнаружение флуоресценции, потому что люминесценция не требует источника света для возбуждения или оптики для выбора дискретных длин волн возбуждения. Типичная люминесцентная оптическая система состоит из светонепроницаемой считывающей камеры и ГУП детектор. Некоторые ридеры используют аналоговый детектор ФЭУ, в то время как другие имеют счет фотонов Детектор ФЭУ. Подсчет фотонов широко признан как наиболее чувствительный способ обнаружения люминесценции. Некоторые считыватели планшетов предлагают оптические системы с фильтром или монохроматором с настраиваемой длиной волны для выбора определенных длин волн люминесценции. Возможность выбора нескольких длин волн или даже диапазонов длин волн позволяет обнаруживать анализы, содержащие несколько люминесцентных репортерных ферментов, разрабатывать новые люминесцентные анализы, а также средства для оптимизации отношения сигнал / шум.[нужна цитата ]

Общие приложения включают люцифераза анализы экспрессии генов, а также анализы жизнеспособности клеток, цитотоксичности и биоритмов на основе люминесцентного обнаружения АТФ.[нужна цитата ]

Флуоресценция с временным разрешением (TRF)

Измерение флуоресценции с временным разрешением (TRF) очень похоже на измерение интенсивности флуоресценции (FI). Единственное отличие - это время процесса возбуждения / измерения. При измерении ИФ процессы возбуждения и испускания происходят одновременно: свет, излучаемый образцом, измеряется во время возбуждения. Несмотря на то, что эмиссионные системы очень эффективны при удалении возбуждающего света до того, как он достигнет детектора, количество возбуждающего света по сравнению с эмиссионным светом таково, что измерения FI всегда показывают довольно высокие фоновые сигналы. TRF предлагает решение этой проблемы. Он основан на использовании очень специфических флуоресцентных молекул, называемых лантаноиды, которые обладают необычным свойством испускаться в течение длительных периодов времени (измеряемых в миллисекундах) после возбуждения, когда большинство стандартных флуоресцентных красителей (например, флуоресцеин) испускаются в течение нескольких наносекунд после возбуждения. В результате можно возбуждать лантаноиды с помощью импульсного источника света (например, ксеноновой импульсной лампы или импульсного лазера) и проводить измерения после импульса возбуждения. Это приводит к более низкому фону измерений, чем в стандартных анализах FI. Недостатки заключаются в том, что оборудование и реагенты обычно более дороги, и что приложения должны быть совместимы с использованием этих очень специфических лантаноидных красителей. Основное применение TRF находится в приложениях для скрининга лекарств в форме, называемой TR-FRET (перенос энергии флуоресценции с временным разрешением). TR-FRET анализы очень надежны (ограниченная чувствительность к нескольким типам помех) и легко миниатюризируются. Надежность, возможность автоматизации и миниатюризации - это особенности, которые очень привлекательны для скрининговых лабораторий.[нужна цитата ]

Поляризация флуоресценции

Измерение поляризации флуоресценции также очень близко к обнаружению FI. Разница в том, что оптическая система включает поляризационные фильтры на пути света: образцы в микропланшете возбуждаются поляризованным светом (вместо неполяризованного света в режимах FI и TRF). В зависимости от подвижности флуоресцентных молекул, обнаруженных в лунках, излучаемый свет будет либо поляризованным, либо нет. Например, большие молекулы (например, белки) в растворе, которые вращаются относительно медленно из-за своего размера, будут излучать поляризованный свет при возбуждении поляризованным светом. С другой стороны, быстрое вращение более мелких молекул приведет к деполяризации сигнала. Система излучения планшет-ридера использует поляризационные фильтры для анализа полярности излучаемого света. Низкий уровень поляризации указывает на то, что небольшие флуоресцентные молекулы свободно перемещаются в образце. Высокий уровень поляризации указывает на то, что флуоресцентный элемент присоединен к более крупному молекулярному комплексу. В результате одним из основных применений обнаружения FP являются анализы связывания молекул, поскольку они позволяют определить, связывается ли небольшая флуоресцентная молекула (или нет) с более крупной нефлуоресцентной молекулой: связывание приводит к более низкой скорости вращения флуоресцентная молекула, и в увеличении поляризации сигнала.[нужна цитата ]

Рассеяние света и нефелометрия

Рассеяние света и нефелометрия - это методы определения мутности раствора (т. Е. Нерастворимых частиц в растворе). Луч света проходит через образец, и свет рассеивается взвешенными частицами. Измеренный свет, рассеянный вперед, показывает количество нерастворимых частиц, присутствующих в растворе. Обычные приложения нефелометрии / светорассеяния включают автоматизированный скрининг растворимости лекарственного средства HTS, долгосрочную кинетику роста микробов, флокуляцию, агрегацию и мониторинг полимеризации и осаждения, включая иммунопреципитацию.[нужна цитата ]

Инструменты и анализы

Многие из режимов обнаружения (поглощение, интенсивность флуоресценции, люминесценция, флуоресценция с временным разрешением и поляризация флуоресценции) доступны отдельно в специализированных считывателях планшетов, но очень часто сегодня их можно объединить в один прибор (многорежимный считыватель планшетов). Существуют также инструменты для измерения динамического или статического света, рассеянного образцами в микропланшете. Спектр приложений для многорежимных считывателей планшетов чрезвычайно велик. Некоторые из наиболее распространенных анализов:

Хотя «считыватель планшетов» обычно относится к устройствам, описанным выше, существует множество вариантов. Вот некоторые примеры других устройств, работающих с форматом микропланшетов:

  • ELISPOT планшет-ридеры, используемые для подсчета цветных пятен, образующихся в ходе анализов ELISPOT.
  • Устройства формирования изображений с высокой пропускной способностью, которые могут одновременно измерять все лунки микропланшета
  • Скрининг с высоким содержанием (HCS) системы, которые отображают каждую лунку с высоким разрешением, чтобы посмотреть на популяции клеток
  • Инструменты без этикеток, которые используют специализированные микропланшеты для измерения событий связывания без использования химических маркеров

Известными разработчиками планшетных ридеров являются компании BioTek, BMG Labtech, Молекулярные устройства, ПеркинЭлмер и Thermo Fisher Scientific.

Рекомендации

  1. ^ Невес, Бруно Жуниор; Агнес, Джонатан Пауло; Гомеш, Марсело ду Насименту; Энрикес Донза, Марсио Роберто; Гонсалвеш, Розангела Майер; Делгобо, Марина; Рибейро де Соуза Нето, Лауро; Сенгер, Марио Роберто; Сильва-Жуниор, Флориано Паес; Феррейра, Сабрина Баптиста; Занотто-Филхо, Алфеу (01.03.2020). «Эффективная идентификация новых соединений свинца против глиомы с помощью моделей машинного обучения». Европейский журнал медицинской химии. 189: 111981. Дои:10.1016 / j.ejmech.2019.111981. ISSN  0223-5234.
  2. ^ Ashour, Mohamed-Bassem A .; Джи, Ширли Дж .; Гамак, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного микропланшета для измерения рутинной активности ферментов». Аналитическая биохимия. 166 (2): 353–360. Дои:10.1016/0003-2697(87)90585-9. PMID  3434778.
  3. ^ Мосманн, Тим (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ клеточного роста и выживаемости: применение для анализа пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов. 65 (1–2): 55–63. Дои:10.1016/0022-1759(83)90303-4. PMID  6606682.
  4. ^ Sims, G.K .; Ellsworth, T. R .; Малвани, Р. Л. (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабное определение неорганического азота в водных и почвенных вытяжках». Коммуникации в области почвоведения и анализа растений. 26 (1–2): 303–316. Дои:10.1080/00103629509369298.
  5. ^ Greenan, N.S .; Mulvaney, R.L .; Симс, Г. К. (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабный метод колориметрического определения мочевины в почвенных экстрактах». Коммуникации в области почвоведения и анализа растений. 26 (15–16): 2519–2529. Дои:10.1080/00103629509369465.
  6. ^ Тор, Джейсон М .; Сюй, Кайфэнь; Штуки, Джозеф М .; Wander, Мишель М .; Симс, Джеральд К. (август 2000 г.). «Распад трифлуралина в условиях микробиологически индуцированного восстановления нитрата и Fe (III)». Экологические науки и технологии. 34 (15): 3148–3152. Bibcode:2000EnST ... 34.3148T. Дои:10.1021 / es9912473.
  7. ^ Д'Анджело, Элиза; Crutchfield, J .; Вандивьер, М. (ноябрь 2001 г.). «Быстрое, чувствительное, микромасштабное определение фосфатов в воде и почве». Журнал качества окружающей среды. 30 (6): 2206–2209. Дои:10.2134 / jeq2001.2206. PMID  11790034.
  8. ^ Rhine, E.D .; Mulvaney, R.L .; Pratt, E. J .; Симс, Г. К. (1998). «Улучшение реакции Бертело для определения аммония в почвенных экстрактах и ​​воде». Журнал Американского общества почвоведов. 62 (2): 473. Bibcode:1998SSASJ..62..473R. Дои:10.2136 / sssaj1998.03615995006200020026x.
  9. ^ Ashour, Mohamed-Bassem A .; Джи, Ширли Дж .; Гамак, Брюс Д. (1987-11-01). «Использование 96-луночного ридера для микропланшетов для измерения рутинной активности ферментов». Аналитическая биохимия. 166 (2): 353–360. Дои:10.1016/0003-2697(87)90585-9. ISSN  0003-2697.
  10. ^ Супрун, Мария; Геттс, Роберт; Рагхунатан, Рохит; Гришина, Галина; Витмер, Марк; Хименес, Густаво; Sampson, Hugh A .; Суарес-Фариньяс, Майте (5 декабря 2019 г.). «Новый анализ эпитопа на основе шариков - чувствительный и надежный инструмент для профилирования репертуара эпитоп-специфических антител при пищевой аллергии». Научные отчеты. 9 (1): 18425. Bibcode:2019НатСР ... 918425С. Дои:10.1038 / s41598-019-54868-7. ЧВК  6895130. PMID  31804555.